Вирус имунодифицита человека внедряется в хромосому хозяина и фактически становится частью его генома, передаваясь при клеточном делении. К настоящему времени все виды лечения СПИДа направлены на ингибирование ферментов ВИЧ или на предотвращение слияния вируса с клеткой, но не на сам провирус, интегрировавшийся в геном. Модифицированный фермент Cre-рекомбиназа способнен «вырезать» ВИЧ из генетического кода культуры инфицированных человеческих клеток. Возможно, это позволит разработать метод полного излечения от СПИДа.
РНК-содержащий ретровирус ВИЧ состоит из липидной мембраны, «населенной» трансмембранными гликопротеинами gp41 и gp120, и содержит ферменты обратную транскриптазу и интегразу, способствующие превращению генетического материала вируса в ДНК и встраиванию его в геном инфицированной клетки.
Геном ретровируса иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV-1) состоит из одноцепочечной молекулы РНК, которая, прежде чем встроиться в хромосомы человека, преобразуется в форму двухцепочечной ДНК с помощью обратной транскриптазы, содержащейся в вирусной частице. Само встраивание происходит с участием интегразы (также находящейся в вирионе) по специальным att-сайтам (attachment), фланкирующим геном вируса в составе длинных концевых повторов (LTR, long terminal repeat). В то же время, схожим образом действуют и другие ДНК-ферменты – транспозазы и сайт-специфические рекомбиназы, вырезающие определенные фрагменты ДНК из хромосом, «ориентируясь» по специфическим нуклеотидным последовательностям, служащим «указателями» для вырезания.
Возникла идея, что одна из существующих рекомбиназ может быть модифицирована таким образом, чтобы распознавать вирус в хромосоме человека и вырезАть его. Исследователи из немецких институтов Молекулярной биологии и генетики Макса Планка и Экспериментальной вирусологии и иммунологии [1] выбрали для эксперимента Cre-рекомбиназу бактериофага P1, широко используемую в генетической инженерии для внедрения или удаления генов в эукариотах. Этот фермент способен, в частности, удалять из хромосомы участки ДНК, расположенные в пределах сайта loxP (см. схему).
Длинные концевые повторы, фланкирующие вирусную ДНК в хромосомах человека, содержат области, на 50% идентичные loxP-сайту, названные сайтом loxLTR. Однако Cre-рекомбиназа не распознает этот сайт и не удаляет вирус из ДНК человека. Саркар с сотр. разработали модифицированную версию этого фермента, названную ими Tre-рекомбиназой, которая практически полностью удалила вирус из ДНК в культуре инфицированных клеток человека за несколько месяцев. В своих экспериментах они использовали метод направленной белковой эволюции, основанный на взаимодействии этого фермента с субстратом см. схему.
«Вырезание» ВИЧ. Cre-рекомбиназа распознает на хромосоме loxP-, но не loxLTR-сайты (характерные для вирусного генома). Цветные полоски на стрелках отражают различия последовательностей этих сайтов.
Саркар с сотр. Sarkar et al. провели «in vitro эволюцию» Cre-рекомбиназы, получив Tre-рекомбиназу, распознающую loxLTR-сайт. Фермент Tre способен удалять из ДНК культуры клеток человека провирус ВИЧ.
loxP-сайт представляет из себя последовательность длиной 34 нуклеотидные пары, с двумя обращенными повторами длиной 13 пар нуклеотидов, фланкирующих «8-остаточный» центральный фрагмент.
Несмотря на то, что впервые удалось физически удалить вирус иммунодефицита из клетки (а не просто инактивировать его), до появления универсального лекарства от СПИДа, основанного на этой технологии, еще очень далеко.
Описанный эксперимент проводился на культуре клеток, зараженных одной и той же формой провируса, в то время как наиболее мощным оружием вируса является его «многоликость» и способность быстро видоизменяться, приспосабливаясь направленному против него к лекарству. Сайт loxLTR довольно консервативен среди изученных форм ВИЧ, но в некоторых случаях идентичность с loxP падает до 30%, и, скорее всего, для эффективной борьбы с вирусом понадобится действие сразу нескольких Tre-подобных форм фермента.
Кроме того, необходимо тщательнейшее изучение действия рекомбиназы на организм – ведь важно не только исцелить зараженные клетки, но и не погубить здоровые. Для излечения необходимо очень выборочно доставить Tre-подобный фермент в Т-лимфоциты типа CD4, которые являются наиболее типичным «прибежищем» ВИЧ, и это тоже задача не из простых.
Литература:
Sarkar, I., Hauber, I., Hauber, J., Buchholz, F. (2007). . Science 316, 1912–1915;
Buchholz, F., Stewart, A.F. (2001). Nat Biotechnol 19, 1047–1052;
Engelman, A. (2007). Science 316, 1855–1857.
Антон Чугунов
|
